МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ КЛІТИН

Розділ 3 Клітинний рівнь організації живої природи

Тема 6. Структура клітинного рівня: біомолекули та органели клітин

§ 32. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ КЛІТИН

Терміни та поняття: мікроскопія: світлова, електронна, центрифугування, авторадіографія, мікрохірургія, метод культури клітин, гібридизація клітин, цитотехнологія, нанозонд.

Мікроскопія. Розмір клітин здебільшого становить від 0,001 до 0,1 мм, а відтак їх не можна побачити без мікроскопа. Більш того, клітини настільки малі, що їх будову неможливо не тільки вивчити, але й навіть зрозуміти

без спеціальних збільшувальних приладів. Саме тому головним методом дослідження клітин є мікроскопія (від грец. мікрос – дрібний і скопус – бачу) – вивчення мікрооб’єктів за допомогою спеціальних приладів – мікроскопів.

Мал. 170.Сучасний світловий мікроскоп

Мал. 171.Електронно-фонний скануючий мікроскоп “Quanta 200 3D”

Оптична мікроскопія. Відкриття клітинної будови всіх живих істот сталося завдяки винайденню світлового мікроскопа (мал. 170), в якому використовується збільшувальна здатність опуклих лінз. Цей прилад збільшує

зображення дрібних предметів, яких не здатне сприйняти око людини, у 2 500 разів. В основу світлової мікроскопії покладено оптичні властивості світла, а межі роздільної здатності мікроскопа (мінімальна відстань між двома точками, які можна побачити окремо) визначаються довжиною світлової хвилі. Тому частки, коротші за довжину світлової хвилі, у звичайний мікроскоп розглянути неможливо. Око людини здатне розрізняти дві лінії, що розташовані на відстані 0,1-0,2 мм, а світло вий мікроскоп допомагає розглянути два об’єкти, які розташовані один від одного на відстані близько 0,001 мм.

Звичайна світлова мікроскопія призначена для вивчення пофарбованих препаратів на предметних скельцях. За допомогою світлової мікроскопії можна досліджувати рухливість мікроорганізмів. Для цього застосовують метод висячої краплі. Невелику краплю мікробної суспензії наносять на середину покривного скла. Предмет не скло з поглибленням (“лункою”), краї якого змазані вазеліном, обережно накладають на покривне скло так, щоб крапля досліджуваної рідини опинилася в центрі заглиблення, щільно притискають до скла і швидко перевертають догори. Для дослідження препарату використовують імерсійний об’єктив, який занурюють у імерсійну олію на покривному склі.

Сучасні мікроскопи поєднанні з комп’ютерами, вони здатні давати об’ємне зображення не тільки клітини, але й окремих її структур і зразу ж виводити їх на екран монітора.

Електронна мікроскопія (ЕС). У 50-ті роки XX ст. для дослідження клітини було застосовано електрон ну мікроскопію (мал. 171), завдяки якій стало можливим збільшувати зображення мікрооб’єктів у сотні тисяч разів. Якщо прийняти роздільну здатність ока людини за одиницю, то роздільна здатність світлового мікроскопа дорівнюватиме 500 одиницям, а електронного – 100 000! Принцип дії електронного мікроскопа відрізняється від світлового тим, що на клітинні структури діє не потік фотонів, а потік електронів, довжина хвилі якого у мільйони разів менша за довжину хвилі світла. Саме це дає змогу розглянути найдрібніші частини клітин, розмір яких становить тисячні частки міліметра. Біологічні об’єкти для досліджень методом ЕМ поміщають на мідні сіточки, що вкриті тонкими плівками (вольфрам, вуглець), що складаються в основному з вуглецю. Біологічні об’єкти також в основному містять вуглець, тому по щільності лише трохи відрізнятися від фона, будуть мало контрастними. Контраст біологічних об’єктів можно підвищити, використовуючи важкі метали або їх солі. Механізм роботи електронного мікроскопа полягає в наступному: потік електронів, джерелом якого є вольфрамова нитка розжарення (нагадує ту, що є в звичайній лампочці), спочатку за допомогою магнітів фокусують, а потім спеціальними лінза ми спрямовують на досліджуваний об’єкт. Далі отримане зображення за допомогою інших лінз збільшують, а потім воно потрапляє на екран, де можна спостерігати зображення об’єкта (мал. 172). Якщо зображення спроектовано на фотопластинку – це електронна мікрофотографія.

Мал. 172.Принцип роботи електронного мікроскопа: 1 – електронна пушка; 2 – анод; 3 – магнітні лінзи; 4 – зразок; 5 – дифракційна картина; 6 – зображення

За допомогою електронного мікроскопа було детально вивчено будову клітинної мембрани і цитоплазми. Це дало змогу дійти висновку, що клітина, всупереч попереднім уявленням про неї як про мішечок з рідиною, насправді всередині має густу сітку каналів, утворених мембранами. Електронно-мікроскопічні дослідження нерозривно пов’язані з вивченням хімічних процесів, що відбуваються у клітині.

Фізичні методи дослідження. Особливим фізичним методом дослідження клітин є центрифугування. За допомогою лабораторних центрифуг відбувається розкла-дання клітин них структур на компоненти відповідно до їх питомої ваги. Так вивчаються властивості не лише кожної частини клітини, а й окремих молекул ДНК, РНК або білка.

Крім того, важливим методом вивчення клітин стала авторадіографія. Для цього до середовища, що оточує клітину, додають радіоактивні речовини, наприклад радіоактивний оксид вуглецю. Клітина його поглинає, і він починає брати участь у хімічних реакціях, розподіляючись по цитоплазмі. Потім тонкі зрізи клітин поміщають на плівку, чутливу до радіоактивного опромінення. В місцях, де знаходиться радіоактивна речовина, з’являються темні плями – клітина начебто сама себе фотографує (звідси і пішла назва авторадіографія). Розглядаючи такі мікрофотографії, можна відстежити не лише стадії синтезу речовин у клітині, але й визначити, в яких саме частинах клітини йде цей процес і навіть його швидкість.

Дослідження живих клітин. Одним із найцікавіших методів дослідження клітини є мікрохірургія. Саме за допомогою цього методу здійснюється перенос окремих органел (ядер, хлоропластів, пластидів клітинних мембран) з однієї клітини до іншої (мал. 173). Завдяки мікрохірургії було виявлено функцію ядра як органа, що визначає форму клітини й характер її функціонування.

Мал. 173. Мікрохірургічна операція на клітині

За допомогою мікроманіпулятора клітини розрізають, витягують з них частини, вводять речовини (мікро – ін’єкції) тощо. Мікроманіпулятор поєднують із звичайним мікроскопом, в який спостерігають за ходом операції. Мікрохірургічни ми інструментами слугують скляні гачки, ігли, капиляри, що мають мікроскопічні розміри. При мікроманіпуляціях клітини поміщають у спеціальні камери, в які вводят також інструменти. Так, за допомогою мікроманіпулятора вдалося пересадити ядра від одного штама амеби другому і довести, що саме ядро визначає фізіологічні особливості клітини в цілому. За допомогою таких мікрохірургичних інструментів можна вводити в живу клітину антитіла або інші білкові молекули. Окрім механічного впливу на клітини в мікрохірургії останніх часів широко застосовують мікропучки ультрафіолетового світла або лазерні мікропучки. Це дозволяє практично моментально інактивувати окремі ділянки живої клітини.

Окремою галуззю клітинної біології є метод культури клітин, за якого ізольовані клітини тварин і рослин переносять у спеціально створене середовище, де клітини здатні не лише жити, а й розмножуватися. Особливий інтерес становить гібридизація клітин, коли клітини різних організмів, наприклад тютюну й троянди, або людини й миші, після попередньої обробки “зливають” в одну клітину. Із гібридних рослинних клітин можуть вирости справжні рослини, а у тварин такі клітини нежиттєздатні.

Метод зондування. Протягом останніх років були зроблені численні спроби спроектувати, апробувати та впровадити як ефективний засіб дослідження живої клітини нанозонд. Американськими науковцями створено зонд, який дозволяє проводити моніторинг електрохімічних та біохімічних процесів, що відбуваються у живій клітині та окремих її органелах. Розробники приєднали до зонда, який проводить електричний струм, нанотрубку з бор нітриду (BN), що має відігравати роль ізолятора наноелектрода. Після цього пристрій вкрили шаром золота завтовшки 10-15 на – нометрів, зверху нанесли полімерне покриття. Завдяки тому, що нанотрубку приєднали до більш масивної основи, маніпулювання “робочим зондом” у клітині спростилося. Експериментальний зразок настільки мініатюр ний, що його можна занурити у ядро чи окрему мітохондрію.

Шведські науковці розробили внутрішньоклітинний на-носенсор, який вимірює рівень клітинного рН, що дозволяє визначити стан клітини. У ролі наносенсорів вони використали наноштирі з цинк(ІІ) оксиду діаметром 80-100 і довжиною 900 нанометрів, які настільки чутливі, що можуть визначати окремі хімічні сполуки в різних частинах живої клітини. Сенсор має вигляд голки, на кінці якої розміщено зонд діаметром 1,4 мікрона. Завдяки великій кількості складових частин зонд може вимірювати навіть слабкий електро механічний потенціал, який супроводжує приєднання різноманітних біомолекул. Зонд не завдає шкоди клітині і дозволяє зберегти її життєздатність і після вимірів.

Клітини – це надзвичайно малі за розміром об’єкти, тому їх можна вивчати виключно за допомогою спеціальних методів і приладів. Головним способом дослідження клітин була, є і буде мікроскопія. Останнім часом з’явилися нові методи дослідження клітини: мікрохірургія, цитотехнології тощо.