Реаплікація ДНК

МЕДИЧНА БІОЛОГІЯ

Розділ 1

БІОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ ЛЮДИНИ

1.2. Молекулярно-генетичний і клітинний рівні організації життя

1.2.3. Спадковий апарат еукаріотичних клітин і його функціонування на молекулярному рівні

1.2.3.3. Реаплікація ДНК

Унікальна властивість молекули ДНК подвоюватися перед поділом клітини називається реплікацією. Ця властивість зумовлена особливістю будови молекули ДНК, що складається з двох комплементарних ланцюгів. Реплікація відбувається в ядрі під час Б-періоду інтерфази. На цей час хромосоми

під світловим мікроскопом не виявляються.

Реплікація ДНК – найважливіший молекулярний процес, що є в основі всіх різновидів поділу клітин, усіх типів розмноження, а, значить, в основі забезпечення тривалого існування окремих індивідуумів, популяцій і всіх видів живих організмів. Для кожного виду дуже важливо підтримувати сталість свого генотипу та фенотипу, а значить, зберігати незмінність нуклеотидної послідовності генетичного коду. Для цього необхідно абсолютно точно відтворювати молекули ДНК перед кожним поділом клітини, тобто основне функціональне значення реплікації – забезпечення

нащадка стабільною генетичною інформацією розвитку, функціонування і поведінки.

Напівконсервативний шлях реплікації ДНК. Встановлено (М. Мезельсон, Ф. Сталь), що в процесі реплікації дві нитки ДНК розділяються, кожна з них є шаблоном (матрицею) для синтезу вздовж неї нової нитки. Послідовність основ, що повинні бути в нових нитках, можна легко передбачити, тому що вони комплементарні основам, що присутні у старих нитках. Таким чином, утворюються дві дочірні молекули, ідентичні материнській. Кожна дочірня молекула складається з однієї старої (материнської) нитки й однієї нової нитки. Оскільки тільки одна материнська нитка збережена в кожній дочірній молекулі, такий тип реплікації має назву напівконсервативного (рис. 1.52).

Рис. 1.52. Напівконсервативний механізм реплікації ДНК:

1 – батьківська молекула ДНК; 2 – нова дочірня молекула ДНК; З – материнський ланцюг; 4 – дочірній ланцюг.

Кожен з двох ланцюгів материнської молекули ДНК використовується як матриця для синтезу нових комплементарних ланцюгів.

Механізм реплікації ДНК. Реплікація ДНК – складний, багатоступеневий процес, що вимагає залучення великої кількості спеціальних білків і ферментів. Наприклад, ініціаторні білки утворюють реплікаційну вилку, ДНК-топоізомерази розкручують ланцюги, ДНК-геліказа і дестабілізуючий білок розщеплюють ДНК на два окремих ланцюги, ДНК-полімераза і ДНК-праймаза каталізують полімеризацію нуклеотидтрифосфатів і утворення нового ланцюга, ДНК-лігази руйнують РНК-затравки на відстаючих ланцюгах ДНК та ін. (рис. 1.53). Процес відбувається аналогічно як у прокаріотів, так і в еукаріотів, хоча дещо відрізняється за швидкістю, спрямованістю, кількістю точок реплікації тощо. Швидкість реплікації в еукаріотів дуже велика і складає 50 нуклеотидів за секунду, а в прокаріотів ще вища – до 2000 нуклеотидів за секунду.

Рис. 1.53. Процес реплікації ДНК:

1 – синтезований ланцюг; 2 – матриця для синтезу ведучого ланцюга; 3 – ДНК-полімераза на ведучому ланцюгу; 4 – ДНК-геліказа; 5 – дестабілізуючий білок; 6 – ДНК-праймаза;

7 – праймер; 8 – матриця для синтезу відстаючого ланцюга; 9 – ДНК-полімераза на відстаючому ланцюгу.

Точність реплікації забезпечується комплементарною взаємодією азотистих основ матричного ланцюга і ланцюга, що будується. Крім цього, весь процес контролюється ДНК-полімеразою, що само – корегує та усуває помилки синтезу.

Основні етапи реплікації:

1. Ініціація (від лат. іnitialis – первинний, початковий). Активація дезоксирибонуклеотидів. Монофосфати дезоксирибонуклеотидів (АМФ, ГМФ, ЦМФ, ТМФ) знаходяться у стані “вільного плавання” в ядрі і є “сировиною” для синтезу ДНК. Для включення в ДНК вони активуються в результаті взаємодії з АТФ. Ця реакція називається фосфорилуванням і каталізується ферментом фосфорилазою. При цьому утворюються трифосфати дезоксирибонуклеотидів, такі як АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ. У такому вигляді вони енергезовані та здатні до полімеризації.

Розпізнавання точки ініціації. Розкручування ДНК починається з певної точки. Така особлива точка називається точкою ініціації реплікації (спеціальна послідовність нуклеотидів). Для визначення точки ініціації необхідні специфічні білки-ініціатори. У вірусів і прокаріотів є тільки одна точка ініціації. В еукаріотів, що мають великі молекули ДНК, може бути багато точок ініціації реплікації, що, зрештою, зливаються одна з одною при повному роз’єднанні ланцюгів ДНК.

Реплікація обох ланцюгів ДНК відбувається одночасно і безупинно.

Розкручування молекули ДНК. Подвійна спіраль ДНК розкручується і розгортається на окремі нитки ДНК шляхом розриву слабких водневих зв’язків між комплементарними нуклеотидами. Цей процес забезпечують ферменти – гелікази. Оголені основи А, Т, Г і Ц обох ланцюгів проектуються в каріоплазму.

Ферменти, що названі топоізомеразами, розривають і заново зшивають окремі нитки ДНК, допомагають розкручуванню спіралі. Завдяки роз’єднанню ланцюгів ДНК виникають реплікаційні вилки. Нові нитки ДНК утворюються на кожному із звільнених ланцюгів, їх ріст відбувається в протилежних напрямках.

2. Елонгація. Вільні трифосфати дезоксирибонуклеотидів своїми азотистими основами приєднуються водневими зв’язками до азотистих основ обох ланцюгів ДНК, відповідно до правила комплементарності, тобто А-Т, Ц-Г (рис. 1.54).

Рис. 1.54. Елонгація – основна реакція при синтезі нових молекул ДНК:

1 – новий синтезований ланцюг; 2 – матричний ланцюг ДНК; 3 – рибонуклеотидтрифосфат, що надходить; 4 – основа.

Елонгація – це додавання дезоксирибонуклеоти – ду до З’-кінця ланцюга, що росте. Процес каталізується ДНК-полімеразою.

Трифосфати дезоксирибонуклеотидів (тринуклео – тиди), приєднуючись до кожного ланцюга ДНК, розривають свої внутрішні високоенергетичні зв’язки й утворюють монофосфати дезоксирибонуклео – тидів (мононуклеотиди), що є звичайними компонентами ДНК. При цьому в нуклеоплазму надходять пірофосфатні молекули, що звільнилися (Р-Р).

Утворення нових ланцюгів ДНК. У подальшому приєднані сусідні нуклеотиди зв’язуються між собою фосфорними залишками та утворюють новий ланцюг ДНК. Процес каталізується ферментом ДНК-полімеразою. При цьому необхідна присутність іонів металів Мn2+ або Mg2+. ДНК-полімераза може полімеризувати дезоксирибонуклеотиди в напрямку 5-3′, тобто від вуглецевого 5′-кінця до вуглецевого З’-кінця молекул ДНК. Оскільки дві нитки ДНК є антипаралельними, нові нитки повинні утворюватися на старих (материнських) нитках у протилежних напрямках. Одна нова нитка утворюється в напрямку 5′-3′. Ця нитка називається провідною. На другій материнській нитці утворюються короткі сегменти ДНК у напрямку 3′-5′. Згодом вони з’єднуються разом, утворюючи довгу відстаючу нитку (рис. 1.55).

Рис. 1.55. Утворення праймерів другого ланцюга ДНК і синтез відстаючого дочірнього ланцюга:

1 – праймер; 2 – синтез відстаючого ланцюга; З – синтез провідного ланцюга; 4 – фрагмент Окадзакі; 5 – синтезовані ланцюги ДНК.

Утворення праймерів. На відстаючій нитці спочатку утворюється короткий ланцюг РНК за шаблоном ДНК. Вона називається РНК-праймером і містить послідовність із 10-60 нуклеотидів. Фермент праймаза каталізує полімеризацію блоків РНК (А, У, Г, Ц) у праймері. РНК-праймер утворюється тому, що ДНК-полімераза не може ініціювати синтез нової нитки ДНК у відстаючому ланцюгу в напрямку 3′-5′, вона тільки може каталізувати її ріст. Праймери пізніше віддаляються, а порожнини, які утворилися, заповнюються дезоксирибонуклеотидами ДНК у напрямку 5′-3′, що завершує побудову другого ланцюга. На місці праймерів утворюються фрагменти нового ланцюга ДНК, які називаються фрагментами Окадзакі і складаються із 100200 нуклеотидів. Ці фрагменти легуються (зшиваються) полінуклеотидлігазами, в результаті чого утворюється другий повноцінний ланцюг. Цей процес називається дозріванням.

Редагування. Чітка комплементарність пар основ забезпечує точну реплікацію ДНК. Однак іноді виникають помилки в приєднанні основ. Вони видаляються ДНК-полімеразою, яка для цього знову зв’язується з молекулами ДНК (репарація).

3. Термінація (від лат. terminalis – кінцевий). Після завершення процесу реплікації молекули, що утворилися, розділяються, і кожна дочірня нитка ДНК скручується разом з материнською в подвійну спіраль. Так утворюються дві молекули ДНК, ідентичні материнській. Вони формуються окремими фрагментами по довжині хромосоми. Такий окремий фрагмент ДНК, що подвоюється на одній хромосомі, називається репліконом. Виникає відразу декілька репліконів, причому асинхронно й у різних її ділянках. Процес реплікації стосується всієї хромосоми та перебігає практично одночасно, з однаковою швидкістю. Після завершення реплікації в реплі – конах вони зшиваються ферментами в одну молекулу ДНК. У клітині людини, що ділиться, утворюється більше 50000 репліконів одночасно. Довжина кожного з них 30 мкм. Завдяки великій кількості репліконів швидкість реплікації збільшується в тисячі разів. Тривалість процесу подвоєння генетичного матеріалу складає приблизно 10 год. Ділянки хромосом, де починається реплікація, називаються точками ініціації. Вважають, що це, ймовірно, місця прикріплення інтерфазних хромосом до білків ламели ядерної оболонки. Процес включається цитоплазматичним фактором невідомої природи, що надходить в ядро.. Реплікація перебігає в строго визначеному порядку, тобто спочатку починають реплікуватись одні ділянки хромосом, а пізніше – інші. У синтетичному періоді інтер – фази подвоюється також і кількість гістонових білків, що асоціюються із синтезованими ДНК і утворюють класичну структуру хроматину. Порушення точності реплікації призводить до порушення синтезу білків і розвитку патологічних змін клітин і органів.

Значення реплікації: а) процес є важливим молекулярним механізмом, що лежить в основі всіх різновидів поділу клітин про – й еукаріотів; б) забезпечує всі типи розмноження як одноклітинних, так і багатоклітинних організмів; в) підтримує сталість клітинного складу органів, тканин і організму внаслідок фізіологічної регенерації; г) забезпечує тривале існування окремих індивідуумів; д) забезпечує тривале існування видів організмів; є) процес сприяє точному подвоєнню інформації; ж) у процесі реплікації можливі помилки (мутації), що може призводити до порушень синтезу білків з розвитком патологічних змін.